上游引物一般是根据miRNA的序列设计，在序列前面加上一个tag，以调整tm值，自己没把握的话，可直接让生物公司给设计我在他家设计过，效果还可以；昨天试了一下，用excel把每个碱基放在一个格子里，中间空一行用来画竖线，然后把格子拉到最小。

首先，为你的miRNA 3#39端最后6个碱基写一段完全互补的序列，然后接在一段固定的茎环结构模板序列上，就完成了比如hsamiR10a 5#39 UACCCUGUAGAUCCGAAuuugug 3#39设计的引物就是GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcacaaa 注意到小写部分是跟miRNA最后6个碱基互补的只有这6个碱；miRNA引物设计茎环法+染料法检测设计方法通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上反转录茎环通用序列GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC miRNA序列mmumiR99b5p MIMAT0000132 Mus musculus miR。

第二步连接反应后，逆转录引物杂交到3端接头，开始启动RTPCR 扩增一般是12个循环由于小且片段大小可预测120bp 接头序列加上2030bp miRNA插入片段，文库或多个barcode混合样本通常一起进行切胶回收 由于存在接头二聚体以及非miRNA的连接tRNA和snoRNA，切胶回收非常重要这种文库制备方法导致文库的测序。

microrna引物设计

1、miRWalk，这个生物信息学界的明珠，heidelbergde，是您寻找miRNA靶基因的全方位伙伴它汇集了人鼠大鼠犬牛等多个物种的详尽信息，囊括了基因全长序列上的miRNA结合位点，并与12种权威预测工具DIANAmicroTv40miRandarel2010等的结果进行整合，确保了预测数据。

2、上游引物不能全覆盖miRNA，5‘增加几个碱基后Tm值和下游引物相对应，可以再用软件检查，避免非特异性结合 一般自己设计这种miRNA的RTPCR引物需要不断优化，一次成功的机会较小，要做好心理准备可以选择试剂盒。

3、合成的单链在实验时又一个和模板结合的退火过程，在这个过程中会自动形成茎环结构，如果你的茎环结构设计合理的话我也在类似文献上看到过上游引物含有额外的碱基，上面有说明的，是为了调整Tm值上游引物不能全覆盖miRNA，5‘增加几个碱基后Tm值和下游引物相对应，可以再用软件检查，避免非特异性。

4、在动物中，miRNA的作用原理是不完美匹配mRNA的3#39UTR，通过抑制翻译起始来调控基因表达据此可以设计，你过表达这个miRNA，那么它的靶基因应该是mRNA不怎么变，但翻译中mRNA明显下调符合这一特征的即很有可能是miRNA的直接靶点再结合软件判断，一般就可以很精准了。

5、miRNA引物设计茎环法+染料法检测设计方法通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上反转录茎环通用序列GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACmiRNA序列mmumiR99b5pMIMAT0000132 Mus musculus miR99。

6、miRNA mimics是针对miRNA的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA作用与miRNA的成熟体是一样，可以上调细胞内相应miRNA的含量，但结构略有不同，所以并不等于miRNA或成熟体miRNA，国内也叫模拟物miRNA agomir是在化学合成的mimics上的基础上，经过特殊的化学修饰升级的产品，不只是更稳定，表达时间长这么简单。

7、miRNA可以设计茎环引物反转录，用探针法或者染料法检测这个引物设计都是固定格式的 miRNA引物设计茎环法+染料法检测设计方法通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上反转录茎环通用序列GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGT。

mirna qpcr引物设计

1、个人觉得lncrna更有研究前景，mirna序列段作用单一通过序列互补靶向靶基因降解或者抑制靶基因各种mirna数据库以及针对mirna靶基因预测软件以及数据库甚至高通量实验都已经非常完善但是lncrna是刚处于研究的起始阶段，其功能机制都不太明确，现有研究只能说明lncrna具有多种功能，因此如果你做lncrna可做的东。

2、是否是已知的miRNA如果是已知的miRNA，我建议你到Sanger网站检索一下序列，然后合成相应探针进行NorthernBlot确证，或者利用RTPCR克隆相应片段进行测序，等等，具体用什么检测方法要取决于你的课题需要引用，仅供参考。

3、miRNA mimics是针对miRNA的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA作用与miRNA的成熟体是一样，可以上调细胞内相应miRNA的含量，但结构略有不同所以并不等于miRNA或成熟体miRNA，国内也叫模拟物miRNA agomir是在化学合成的mimics上的基础上，经过特殊的化学修饰升级的产品，不只是更稳定，表达时间长这么。