1、不要合成pam序列，只要保证待结合的片段 在N20结合区域 后面 紧跟着pam序列即可；SgRNA设计方法SgRNAsmallguideRNA简称，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guideRNA，由两部分组成tracRNA和crRNA，两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切SgRNA脱靶问题一直备受关注，如何设计特异性好的靶点成为大家；是sgrna是双链sgRNA双链区是由RNA和DNA互补形成的sgRNA是一个短的合成RNA，只有20bp大小，可以与Cas9蛋白结合，所以在设计sgRNA之前，应在基因组上寻找PAM序列；02 设计成对 sgRNA 序列 打开网站 ，将基因名称，邮箱，第二外显子序列输入到对话框，点击 Agree and submit，等待网站设计成对的 sgRNA 序列一般推荐网站设计，因为网站可以预测脱靶位点数，避免基因脱靶产生当然也可以手动选择特异的 sgRNA 序列设计成对的 sgRNA 序列。

2、以人类CD28基因为例，设计sgRNA靶点时，首先通过NCBI数据库获取基因信息，包括转录本ID转录本数量外显子信息等，从而确定靶区域并获取序列随后，使用CRISPOR设计网站等工具设计sgRNA，确保靶点具有高特异性进行BLAST比对，验证靶点在基因组中的特异性在筛选出高评分靶点后，进行基因编辑载体构建，包括；二Sgrna在基因编辑中的应用 在CRISPRCas9基因编辑系统中，Sgrna扮演着向导的角色科学家通过设计特定的Sgrna序列，能够引导Cas9蛋白到目标DNA序列的特定位点，从而实现对基因组特定位置的切割和编辑这一技术的出现，极大地提高了基因编辑的精准度和效率，为基因治疗遗传疾病研究等提供了强有力的工具；首先，设计sgRNA犹如寻找基因的黄金钥匙，要求我们选取包含内含子和外显子的互补序列创新可能受到限制，但可以通过参考已有的成功构建但未使用的序列，以提高效率这样的在线工具为我们提供了便利，只需输入目标物种和合适的PAM结构，系统会筛选出高评分的候选序列获得sgRNA序列后，务必；we also provide computationally predicted offtarget sites for a detailed discussion， see Box 1 为了解决以上不足之处，张老师课题组提供了在线设计sgRNA的工具，并且也提供了关于脱靶位点的计算方法以及增加编辑效率的alternative strategyusing the D10A nickase mutant of Cas9 Cas9n alon。

3、为进一步提高CRISPRCas9系统的打靶效率，比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA sgRNA的不同载体设计对其打靶效率的影响方法将针对AAVS1位点的2个sgRNA序列分别插入表达Cas9的质粒pSpCas9上，再将其构建为Cas9sgRNA二合一的共质粒以及独立表达sgRNA和Cas9的双质粒系统质粒转染293T细胞后，用。